年非洲猪瘟之后，为了快速诊断与精准剔除，纷纷配置了荧光定量检测设备，用于潜在感染病原的分子生物学快速、精准的诊断（尤其是非洲猪瘟、蓝耳病等），今天跟各位聊聊分子生物学检验测试过程中的一些基本概念，检测结果应用等，便于各位临床兽医对实验室结果的解读与综合诊断应用。

  以基因的cDNA为模板进行PCR扩增，在PCR扩增过程中，通过收集荧光信号，对PCR进程进行实时检测。检测的Ct值和该模板的起始拷贝数的对数之间有线性相关。普通PCR是定性的检测的新方法，而qPCR（又称为real time PCR）是半定量检测方法。

  非洲猪瘟之后，因为qPCR技术的广泛应用，行业人士都知道了“CT值”一词，也知道了“起峰”的基本含义。但什么是CT值呢？

  qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。CT值越小，代表初始模板中目标基因的浓度越高；CT值越高，代表初始模板中目标基因的浓度越低，通常CT值的合理范围是15-35之间。

  是指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。所以在qPCR的结果图中，若试剂盒或反应体系较好的话，前面的图形应该是直线荧光域值（

  个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期。qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在

  早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。

  值的重现性极好，即同一模板在不同时间扩增或同一时间不同管内扩增（有时会受到八连管的质量，反应体系的混合均匀度，加样的操作等影响），得到的

  值的重现性受到人工操作、提取效率、扩增效率等影响，也是检测提取试剂盒与扩增试剂盒品质的关键性指标之一。

  值的重现性来验证不同实验室之间的检验测试能力的差异性。若样品是标准品更佳（维特康实验室出售实验室验证用标准品，若需要，请联系）。

  代表的是某一载体中病毒负荷量，比如血液中的病毒载量（病毒血症）即指的血液中病毒负荷量。对于具有病毒血症的病原来讲，血液中病毒载量的高低是衡量疾病进展的标志，对疾病的传播能力、发展阶段、分期预后估计、疗效观察均有很高的参考价值。

  ，但病毒载量是零，并非意味着猪只不携带病毒，可能在组织内依然存在病毒。研究表明：不同毒力的非洲猪瘟病毒的病毒血症期差异也较大，通常认为，毒力越弱，病毒血症的持续期越短，病毒血症在感染后的呈现时间约晚。2病毒载量与

  ，通过建立的标准曲线通常以CT值表示。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。反之亦然。qPCR检测到的仅为病毒核酸的多少（可能是死亡的病毒核酸片段），其并不能完全代表感染力大小，若要明确病毒的感染力则有必要进行细胞或动物活体实验（病毒活力/毒价一般用TCID50/mL（比如PRRSV）、HAD（比如ASFV）等表示）。临床生产中，用qPCR方法对血液、组织处理液、唾液、组织中的病原进行核酸检验测试，可以反映体内病毒复制（病毒数量）情况；用qPCR方法对车辆、人员、物资等环境样品进行仔细的检测，可以反映样品曾暴露（接触）过病原的情况，有没有感染活力或者传播性，则一定要通过细胞培养的方式进一步评估，其更重要的意义体现在生物安全风险的评估、疾病暴发的提前预警以及疾病暴发后的溯源。CT值与病毒载量的线性关系与样品的提取效率、扩增效率、样品种类、探针引物、反应体系等多因素相关。需要在实验室内，使用某一固定品牌或品类的诊断试剂，通过批内、批间实验进行一直在优化，针对已知病毒含量（一般为质粒）的扩增模板，描绘出标准曲线，从而推断出特定

  ，则任何血液样本或其他样品中该病毒的载量低于这门坎表示病毒量低于可测量的限度，报告中一般显示低于测量值，就是说“测不到”。这并不表示血液或其他样品中没有病毒，而是病毒量在

  之间，因数量太低，仪器无法测出。但是，血液“测不到”的病毒还是会广泛存在于、分泌物、骨髓、内脏中，可能猪只依然具备传播性，从而传播疾病，如：蓝耳病毒、非洲猪瘟病毒等。根据检测的新方法的不同，病毒载量的单位常为：

  值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

  范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。

  CT值在35-40之间），这种结果的临床解释要谨慎，需要认真考虑样品的种类、猪只临床表现及对结果重复采样检测后的重复性等。对于CT值在35-40之间的结果，往往重复检测时，重复性较差。5复孔间重复性差

  这种情况可以从以下几个方面分析：加样准确度、移液器吸取液体的准确度、定期校准

  购买与移液器配套的枪头，若枪头与移液器不匹配，在吸取液体时易出现漏气的现象，导致吸取量程不准确。

  在吸取相同量程的液体体积时，注意仔细观察每次吸取液体在枪头内的液面高度是否一致。

  CT值通常在20-30之间，若CT值过高（如：30-40之间），或者疾病处于早期，或者要鉴别判定是否是因为非洲猪瘟弱毒（变异毒株感染）感染所导致的。一般而言，对于多数病原而言，血液的CT

  CT值来判断物资或人员是否有传染病毒的风险。原因是样品中的病毒含量较低，但可能依然具备感染性，提示我们一定要认真的做好生物安全措施。qPCR给非洲猪瘟、新冠病毒的防控、紧急处置提供了非常大的帮助，但不能以qPCR

  2月份文章：精准拔牙只靠testing吗？），但第6天，尾根血拭子的qPCR值是20-25之间，这也说明拔牙不能只靠qPCR检测，常常要结合临床表现+实验室检测结果综合判断非洲猪瘟的感染风险。其实圆环病毒感染的诊断依据类似（临床症状+

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  若一旦非瘟阳性，博维特的技术顾问必定奔赴一线，使命必达！让我们利用好实验室诊断、临床紧急处置与日常监控的手段，一起构建强大的健康管理体系。